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  <title>细胞生物学研究方法 | Halo</title>
  
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          细胞生物学研究方法
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            <p>细胞生物学 第3章 细胞生物学研究方法</p>
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<a id="more"></a>

<hr>
<h2 id="细胞形态结构的观察方法"><a href="#细胞形态结构的观察方法" class="headerlink" title="细胞形态结构的观察方法"></a>细胞形态结构的观察方法</h2><p><img src="http://img.whl123456.top/image/%E5%87%A0%E7%A7%8D%E6%98%BE%E5%BE%AE%E9%95%9C%E5%8F%AF%E8%A7%82%E5%AF%9F%E7%9A%84%E6%A0%B7%E5%93%81%E5%A4%A7%E5%B0%8F%E5%8F%8A%E5%85%B6%E5%88%86%E8%BE%A8%E8%83%BD%E5%8A%9B.png" alt="几种显微镜可观察的样品大小及其分辨能力"></p>
<h3 id="光学显微镜"><a href="#光学显微镜" class="headerlink" title="光学显微镜"></a>光学显微镜</h3><h4 id="普通复式光学显微镜"><a href="#普通复式光学显微镜" class="headerlink" title="普通复式光学显微镜"></a>普通复式光学显微镜</h4><p><strong>组成</strong>：</p>
<ul>
<li>光学放大系统，为两组玻璃透镜： 目镜与物镜；</li>
<li>照明系统： 包括光源和聚光镜，有时另加各种滤光片以控制光的波长范围；</li>
<li>镜架及样品调节系统。</li>
</ul>
<blockquote>
<p>显微镜最重要的性能参数是分辨率</p>
<p>分辨率是指能区分开两个质点间的最小距离。</p>
</blockquote>
<p><strong>分辨率</strong>：最大分辨率是<strong>0.2μm</strong></p>
<p><strong>用途</strong>：可以直接用于观察单细胞生物或体外培养细胞。</p>
<p>如果观察生物组织样品，则通常需要对所观察的材料进行固定和包埋（常用的固定剂如甲醒，包埋剂如石蜡等），再将包埋好的样品切成厚度约5μm的切片，最后进行染色。</p>
<hr>
<h4 id="相差显微镜"><a href="#相差显微镜" class="headerlink" title="相差显微镜"></a>相差显微镜</h4><p><strong>原理</strong>：</p>
<ul>
<li>当两束光通过光学系统时，如果它们的相位相同，干涉的结果是使光的振幅加大，亮度增强；反之，就会相互抵消而亮度变暗。</li>
<li>光线通过不同密度的物质时，密度大则光的滞留时间长，密度小则光的滞留时间短。因而，其光程或相位发生了不同程度的改变。</li>
</ul>
<p><strong>组成</strong>：在普通光学显微镜的基础上，添加两个元件，即“环状光阑” 和在物镜后焦面上的”相差板”</p>
<blockquote>
<p>从而可将这种光程差或相位差，通过光的干涉作用，转换成振幅差，因此，可以分辨出细胞中密度不同的各个区域</p>
</blockquote>
<h4 id="微分干涉显微镜"><a href="#微分干涉显微镜" class="headerlink" title="微分干涉显微镜"></a>微分干涉显微镜</h4><p>G. Nomarski如在相差显微镜的基础上，发明了微分干涉显微镜</p>
<p><strong>原理</strong>：微分干涉显微镜是以平面偏振光为光源。光线经棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样品的相邻部位，然后再经过另一棱镜将这两束光汇合，从而使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别。</p>
<p><strong>分辨率</strong>：比普通光镜提高了一个数最级</p>
<p><strong>用途</strong>：更适于研究活细胞，将微分干涉显微镜接上高分辨率录像装置，可以用来观察并记录活细胞中的颗粒及细胞器的运动。</p>
<hr>
<h4 id="荧光显微镜"><a href="#荧光显微镜" class="headerlink" title="荧光显微镜"></a>荧光显微镜</h4><p><strong>原理</strong>：</p>
<p>滤光片系统由激发滤光片和阻断滤光片组成。</p>
<blockquote>
<p>激发滤光片：安装在光源和样品之间，只允许特定波长的激发光通过<br>阻断滤光片：安装在物镜和目镜之间，只容许荧光染料所发出的荧光通过</p>
</blockquote>
<p>这样，通过激发滤光片的短波长的激发光，照射标记在样品中的荧光分子上，使之产生一定波长的可见光即荧光。</p>
<p>由于荧光显微镜的暗视野为荧光信号提供了强反差背景，非常微弱的荧光信号亦可得以分辨。</p>
<p><strong>用途</strong>：</p>
<ul>
<li><p>对细胞内特异的蛋白质、核酸、糖类、脂质以及某些离子等组分进行定性定位研究；</p>
</li>
<li><p>观察细胞内动态变化。</p>
<blockquote>
<p>例如，用显微注射器将标记荧光素的肌动蛋白注射到培养细胞中，可以看到肌动蛋白分子组装成肌动蛋白纤维的过程。</p>
<p>又如，将在激发光作用下，可产生荧光的绿色荧光蛋白的基因与编码某种蛋白质的基因相融合，<br>利用荧光显微镜，就可以在表达这种融合蛋白基因的活细胞中，观察到该蛋白的动态变化。</p>
</blockquote>
</li>
</ul>
<h5 id="荧光显微镜样品制备技术"><a href="#荧光显微镜样品制备技术" class="headerlink" title="荧光显微镜样品制备技术"></a>荧光显微镜样品制备技术</h5><ul>
<li><p>免疫荧光技术；</p>
</li>
<li><p>荧光素直接标记技术</p>
<blockquote>
<p>荧光染料DAPI 特异性地直接与细胞中的DNA 相结合，从而显示出细胞核或染色体在细胞中的定位。这是一种常用的直接标记技术。</p>
</blockquote>
</li>
</ul>
<hr>
<h4 id="激光扫描共焦显微镜（LSCM）"><a href="#激光扫描共焦显微镜（LSCM）" class="headerlink" title="激光扫描共焦显微镜（LSCM）"></a>激光扫描共焦显微镜（LSCM）</h4><p><strong>原理</strong>：相当于在荧光显微镜上安装了一套激光共焦成像系统，并以激光（可见或紫外激光） 为光源。</p>
<blockquote>
<p><strong>共焦</strong>：聚光镜和物镜同时聚焦到同一点上</p>
<p>因而只有聚光镜聚焦在样品中的某一位点上所产生的激发荧光才能清晰成像，而来自焦平面以外的散射光则被小孔或狭缝挡住，再利用激光扫描装置和计算机高速采集与处理汇聚每一个点上的信息，形成一幅清晰的二维图像。</p>
</blockquote>
<p><strong>分辨率</strong>：激光扫描共焦显微镜的分辨率可以比普通荧光显微镜的分辨率提高1.4~1.7 倍。其纵向分辨率也得到很大的改善。</p>
<p><strong>用途</strong>：研究亚细胞结构与组分的定位及动态变化等</p>
<hr>
<h3 id="电子显微镜技术"><a href="#电子显微镜技术" class="headerlink" title="电子显微镜技术"></a>电子显微镜技术</h3><h4 id="电子显微镜的基本知识"><a href="#电子显微镜的基本知识" class="headerlink" title="电子显微镜的基本知识"></a>电子显微镜的基本知识</h4><p><strong>电子显微镜与光学显微镜的基本区别</strong>:</p>
<p>电子显微镜的高分辨率主要是因为使用了波长比可见光短得多的<strong>电子束作为光源</strong>，波长一般小于0.1 nm。</p>
<p>光源的差异决定了电镜与光镜的一系列不同点，比如：</p>
<ul>
<li>电子显微镜需要通过电磁透镜聚焦；</li>
<li>电镜镜简中要求高度真空；</li>
<li>图像需要通过荧光屏或感光胶片进行显示和记录等</li>
</ul>
<table>
<thead>
<tr>
<th>显微镜类型</th>
<th>分辨本领</th>
<th>光源</th>
<th>透镜</th>
<th>真空</th>
<th>成像原理</th>
</tr>
</thead>
<tbody><tr>
<td>光学显微镜</td>
<td>200nm</td>
<td>可见光（波长400~700nm）</td>
<td>玻璃透镜</td>
<td>不要求真空</td>
<td>利用样本对光的吸收形成明暗反差和颜色变化</td>
</tr>
<tr>
<td>电子显微镜</td>
<td>0.2nm</td>
<td>电子束（波长0.01~0.9nm）</td>
<td>电磁透镜</td>
<td>1.33x10<sup>-3</sup>~1.33x10<sup>-5</sup>Pa</td>
<td>利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差</td>
</tr>
</tbody></table>
<p>电子显微镜的<strong>分辨本领与有效放大倍数</strong>:分辨率可达0.2nm , 其放大倍数为10<sup>6</sup>倍。</p>
<p>电子显微镜的<strong>基本构造</strong></p>
<p>电子显微镜主要由以下4 部分组成:</p>
<ul>
<li>电子束照明系统</li>
<li>成像系统</li>
<li>真空系统</li>
<li>记录系统</li>
</ul>
<hr>
<h4 id="主要电镜制样技术"><a href="#主要电镜制样技术" class="headerlink" title="主要电镜制样技术"></a>主要电镜制样技术</h4><h5 id="超薄切片技术"><a href="#超薄切片技术" class="headerlink" title="超薄切片技术"></a>超薄切片技术</h5><p><strong>步骤</strong>：</p>
<ul>
<li><p>固定：固定是保持样品的真实性的一个最重要的环节。</p>
<blockquote>
<p>固定不仅要求保持样品的形态和精细结构不发生改变； 有时还要求细胞内部的成分保持在原来的位置上，甚至其免疫原性尽可能的不发生改变。</p>
</blockquote>
</li>
<li><p>包埋：包埋的目的是保证在切片过程中，包埋介质能均匀良好地支撑样品，以便获得连续、完整并有足够强度的超薄切片</p>
</li>
<li><p>切片：切片厚度通常是40~50nm</p>
</li>
<li><p>染色：电镜样品用重金属盐进行染色。</p>
<blockquote>
<p>当电子束穿过样品时，样品中的金属离子不同程度地散射和吸收电子，在样品上形成明暗差别。</p>
<p>因此，电镜下观察到图像只能为黑白图像。</p>
</blockquote>
</li>
</ul>
<p><strong>应用</strong>：</p>
<ul>
<li>几乎可以观察各种细胞的超微结构</li>
<li>与放射同位素自显影、细胞化学、免疫化学和原位杂交等技术结合，在超微结构水平上完成蛋白质与核酸等组分的定性定位和半定量研究。</li>
</ul>
<hr>
<h5 id="负染色技术"><a href="#负染色技术" class="headerlink" title="负染色技术"></a>负染色技术</h5><p>经纯化的细胞组分或结构，如线粒体基粒、核糖体、蛋白颗粒及细胞骨架纤维甚至病毒等可以通过电镜负染色技术显示其精细结构，<strong>分辨率可达1 .5nm左右</strong>。</p>
<p><strong>原理</strong>：负染色是用重金属盐，如磷钨酸或醋酸双氧铀溶液对铺展在载网上的样品进行染色。吸去多余染料，样品自然干燥后，整个载网上都铺上了一薄层重金属盐，从而衬托出样品的精细结构。</p>
<hr>
<h5 id="冷冻蚀刻技术"><a href="#冷冻蚀刻技术" class="headerlink" title="冷冻蚀刻技术"></a>冷冻蚀刻技术</h5><p><strong>原理与步骤</strong>：</p>
<ul>
<li>用快速低温冷冻法，在液氮或液氮中将样品迅速冷冻，然后在低温下进行断裂。</li>
<li>冷冻样品从其结构相对“ 脆弱＂ 的部位（即膜脂双分子层的疏水端）裂开，从而显示出镶嵌在膜脂中的蛋白质颗粒。</li>
<li>再用铅等重金属进行倾斜喷镜，以形成对应于凹凸断裂面的电子反差。</li>
<li>接着，用碳进行垂直喷镀，在断裂面上形成一层连续的碳膜。</li>
<li>最后用消化液把生物样品消化掉，将复型膜（碳膜及其被碳膜包裹的，含有图像信息的金属微粒膜） 移到载网上，并在电镜下进行观察。</li>
</ul>
<p><strong>应用</strong>：</p>
<ul>
<li><p>用来观察膜断裂面上的蛋白质颗粒和膜表面形貌特征。</p>
<blockquote>
<p>图像富有立体感，样品不需包埋甚至也不需要固定，因而能更好地保持样品的真实结构</p>
</blockquote>
</li>
<li><p>进一步发展的<strong>快速冷冻深度蚀刻技术</strong>，可用于观察胞质中的细胞骨架纤维及其结合蛋白。</p>
</li>
</ul>
<hr>
<h5 id="电镜三维重构与低温电镜技术"><a href="#电镜三维重构与低温电镜技术" class="headerlink" title="电镜三维重构与低温电镜技术"></a>电镜三维重构与低温电镜技术</h5><p>电镜三维重构技术</p>
<p><strong>基本步骤</strong>：在不同的倾角下进行拍照，得到一系列电镜图片后再经傅立叶变换等数学处理，从而展现出生物<br>大分子及其复合物三维结构的电子密度图。</p>
<p><strong>应用</strong>：</p>
<ul>
<li><p>尤其适用于分析难以形成三维晶体的膜蛋白以及病毒和蛋白质—核酸复合物等大的复合体的三维结构。</p>
</li>
<li><p>电镜三维重构技术与X射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前在结构生物学领域用于研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。</p>
</li>
</ul>
<hr>
<p>低温电镜技术</p>
<p>在电镜三维重构技术基础上发展了低温电子显微镜技术，其样品不经固定、染色和干燥，直接包被在约100nm厚冰膜中，在电镜内-160℃低温下利用相位衬度成像。</p>
<p><strong>优点</strong>：不仅更真实地展示出生物大分子及其复合物表面与内部的空间结构，而且还具有更高的分辨率。</p>
<blockquote>
<p>近年来，随着低温电镜技术的日趋完善，建立和发展了诸如研究核糖体的三维结构及在蛋白质合成中的动态变化的单颗粒技术，研究细胞和细胞器三维精细结构的电子扫描断层成像技术等，它们在<strong>细胞的结构与功能的研究</strong>中，发挥着其他生物学技术所不可替代的作用。</p>
</blockquote>
<hr>
<h5 id="扫描电镜-SEM-技术"><a href="#扫描电镜-SEM-技术" class="headerlink" title="扫描电镜(SEM)技术"></a>扫描电镜(SEM)技术</h5><p><strong>原理</strong>：电子枪发射出的电子束被磁透镜汇聚成极细的电子”探针“，在样品表面进行”扫描“，激发样品表面放出二次电子，二次电子由探测器收集并被闪烁器转变成光信号，其产生的多少与样品表面的形貌相关。这样，通过扫描电镜可以得到样品表面的立体图像信息。<br><strong>样品处理</strong>：利用CO<sub>2</sub> 临界点干燥法对样品进行干燥处理。此外，为了得到正确的二次电子信号，样品表面需有良好的导电性。所以样品在观察前还要喷镀一层金膜。</p>
<p><strong>分辨率</strong>：一般是3nm。近些年研制的低压高分辨扫描电镜分辨本领可达0.7 nm，可用于观察核孔复合体等更精细的结构。</p>
<blockquote>
<p>直至目前人们还不能用它观察活的生物样品，而且难以观察细胞的全貌。在很多研究中仍需要光镜与电镜技术相结合。</p>
</blockquote>
<h3 id="扫描隧道显微镜（STM）"><a href="#扫描隧道显微镜（STM）" class="headerlink" title="扫描隧道显微镜（STM）"></a>扫描隧道显微镜（STM）</h3><p><strong>原理</strong>：</p>
<p>STM 的主要原理是利用量子力学中的隧道效应，即通常在低电压下，二电极之间具有很大的阻抗，阻止电流<br>通过，称之为<strong>势垒</strong>。</p>
<blockquote>
<p>当二电极之间近到一定距离(100nm以内）时，电极之间产生了电流，称隧道电流，这种现象称隧道效应。</p>
</blockquote>
<p>并且隧道电流（I）和针尖与样品之间的间距(d) 呈指数关系，这样d可转化为I的由数而被测定，针尖的位置就可以确定，由此样品的表面形貌也可确定。</p>
<p><strong>主要装置</strong>：包括实现x、y、 z 3个方向扫描的压电陶瓷，逼近装置、电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。</p>
<p><strong>STM 的主要特点</strong>：</p>
<ul>
<li>具有原子尺度的高分辨本领：侧分辨率为0.1~ 0.2 nm, 纵分辨率可达0. 001nm;</li>
<li>可以在真空、大气、液体（接近于生理环境的离子强度）等多种条件下工作；</li>
<li>属于非破坏性测量。</li>
</ul>
<p><strong>应用</strong>：</p>
<ul>
<li>直接观察到DNA 、RNA 和蛋白质等生物大分子及生物膜、病毒等结构；</li>
<li>用于研究纳米生物学乃至纳米科学各领域。</li>
</ul>
<blockquote>
<p>其功能类似的还有原子力显微镜</p>
<p>原子力显微镜，顾名思义，是利用微小的探针来操纵和测量样品的形貌和力学性质。</p>
<p>这个微小的探针在一个悬梁臂弹簧的末端，在与样品直接作用时，悬梁臂的微小位移通过“ 光杠杆＂ 效应得以放大上千倍投射到光电探测器上，并通过一个反馈通路来控制探针和样品之间的相互作用。</p>
<p>原子力显微镜不仅可以精确地测量出样品的形貌，而且，还可以测量样品的微观力学性质。</p>
<p>其作用力范围在10pN（皮牛）到几十个纳牛之间，恰恰适合干细胞信号分子与配体结合以及蛋白质分子的折叠和展开等研究。</p>
</blockquote>
<h2 id="细胞及其组分的分析方法"><a href="#细胞及其组分的分析方法" class="headerlink" title="细胞及其组分的分析方法"></a>细胞及其组分的分析方法</h2><h3 id="用超离心技术分离细胞组分"><a href="#用超离心技术分离细胞组分" class="headerlink" title="用超离心技术分离细胞组分"></a>用超离心技术分离细胞组分</h3><h4 id="差速离心"><a href="#差速离心" class="headerlink" title="差速离心"></a>差速离心</h4><p><strong>原理</strong>：利用不同的离心速度所产生的不同离心力， 将各种质量和密度不同的亚细胞组分和各种颗粒分开</p>
<p>适用于分离沉降速率差别较大的亚显微结构。</p>
<hr>
<h4 id="密度梯度离心"><a href="#密度梯度离心" class="headerlink" title="密度梯度离心"></a>密度梯度离心</h4><p><strong>原理</strong>：将要分离的细胞组分小心地铺放在含有密度逐渐增加的、高溶解性的介质形成的密度梯度溶液表面， 通过重力或离心力的作用使样品中不同组分以不同的沉降率沉降， 形成不同的沉降带。</p>
<p><strong>沉降率</strong>：沉降率与各组分的形状和大小有关， 通常以沉降系数（S值）表示。</p>
<p><strong>常用的介质</strong>：庶糖和氯化绝等</p>
<p><strong>分类</strong>：</p>
<ul>
<li><p>速度沉降， 主要是用于分离密度相近而大小不一的细胞组分；</p>
</li>
<li><p>等密度沉降， 用于分离不同密度的细胞组分，这种方法非常灵敏，甚至可以将掺入重同位素的生物大分子和未标记物分开。</p>
<blockquote>
<p>1957年，Meselson 和Stahl 利用<sup>15</sup>N标记大肠杆菌DNA , 并用氯化绝等密度沉降法直接证明了DNA 的半保留复制。</p>
</blockquote>
</li>
</ul>
<hr>
<h3 id="细胞成分的细胞化学显示方法"><a href="#细胞成分的细胞化学显示方法" class="headerlink" title="细胞成分的细胞化学显示方法"></a>细胞成分的细胞化学显示方法</h3><p>为了测定蛋白质、核酸、多糖和脂质等细胞组分，通常利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征， 通过显色剂在细胞中的定位及颜色的探浅来判断某种物质在细胞中的分布和相对含最。</p>
<ul>
<li><p><strong>福尔根反应</strong>：特异显示呈紫红色的DNA的分布</p>
<blockquote>
<p><strong>原理</strong>：酸水解可以去除RNA，仅保留DNA , 并除去DNA 上嘌呤脱氧核糖核苷键的嘌呤， 使脱氧核糖的醛基暴露。所暴露的自由醛基与希夫试剂（Schiff’s reagent）反应呈紫红色。</p>
</blockquote>
</li>
<li><p><strong>PAS反应</strong>：用于确定多糖的存在</p>
<blockquote>
<p><strong>原理</strong>：利用过碘酸氧化作用生成醛基， 醛基与碱性品红反应反应产生紫红色化合物</p>
</blockquote>
</li>
<li><p><strong>四氧化饿反应</strong>： 用以证明脂滴的存在</p>
<blockquote>
<p>与不饱和脂肪酸反应呈黑色。</p>
</blockquote>
</li>
<li><p><strong>苏丹Ⅲ染色</strong>：检验脂肪</p>
<blockquote>
<p>苏丹Ⅲ（深红色）通过扩散进入脂滴中 。</p>
</blockquote>
</li>
<li><p><strong>米伦反应</strong>：蛋白质成分检测</p>
<blockquote>
<p>氮汞试剂与组织中的蛋白质侧链上的酪氨酸残基反应， 形成红色沉淀。</p>
</blockquote>
</li>
<li><p><strong>重氮反应</strong></p>
<blockquote>
<p>氢氧化重氮与酪氨酸、色氨酸和组氨酸起反应形成有色的复合物。</p>
</blockquote>
</li>
<li><p>蛋白质中的-SH 基可用形成硫醇盐共价键的试剂进行检测</p>
</li>
<li><p><strong>格莫瑞方法</strong>：检测碱性磷酸酶</p>
<blockquote>
<p>用甘油磷酸酯做底物， 由于酶水解释放的磷酸根， 在钙离子存在的情况下转变成不溶性的磷酸钙， 进而转变成金属银或硫化铅、硫化钴或其他有颜色的化合物， 金属沉淀或颜色的存在部位， 即碱性磷酸酶在细胞中存在的部位。</p>
</blockquote>
</li>
</ul>
<h3 id="特异蛋白抗原的定位与定性"><a href="#特异蛋白抗原的定位与定性" class="headerlink" title="特异蛋白抗原的定位与定性"></a>特异蛋白抗原的定位与定性</h3><p><strong>免疫荧光</strong>与<strong>免疫电镜</strong>是最常见的<strong>研究细胞内蛋白质分子定位</strong>的重要技术</p>
<p>蛋白质组分进行体外分析定性通常则采用免疫印迹、放射免疫沉淀和蛋白质芯片、质谱分析等技术</p>
<hr>
<h4 id="免疫荧光技术"><a href="#免疫荧光技术" class="headerlink" title="免疫荧光技术"></a>免疫荧光技术</h4><p><strong>定义</strong>：免疫荧光技术是将免疫学方法（抗原-抗体特异结合）与荧光标记技术相结合并用于研究特异蛋白抗原在细<br>胞内分布的方法，包括直接和间接免疫荧光技术两种。</p>
<ul>
<li><p>直接免疫荧光技术：将荧光分子与抗体偶联后直接用千免疫标记技术。</p>
</li>
<li><p>间接免疫标记技术：先将抗体（第一抗体） 与抗原反应， 然后加入与荧光分子相偶联的抗第一抗体的抗<br>体（第二抗体）。</p>
</li>
</ul>
<p><strong>实验步骤</strong>：荧光抗体的制备；标本的处理；免疫染色；观察记录。</p>
<blockquote>
<p>标本处理有多种方法， 组织切片、冷冻切片、整装细胞都可应用， 其宗旨只有一个， 即要尽最完好地保持被检测蛋白质的抗原性；</p>
</blockquote>
<p>除免疫荧光技术外， 还可用免疫酶标记技术， 即以酶（如辣根过氧化物酶） 代替荧光素与抗体偶联， 因此可在普通显微镜下观察。</p>
<p>近年来， 激光扫描共焦显微镜的应用使免疫荧光技术在细胞生物学研究中发挥了越来越大的作用。</p>
<hr>
<h4 id="免疫电镜技术"><a href="#免疫电镜技术" class="headerlink" title="免疫电镜技术"></a>免疫电镜技术</h4><p>免疫电镜技术至今已得到广泛应用</p>
<p><strong>定义</strong>：  免疫电镜技术是指将抗体进行特异性免疫反应标记后再在电子显微镜下观察免疫反应结果的技术。</p>
<p><strong>分类</strong>：</p>
<ul>
<li>免疫铁蛋白技术</li>
<li>免疫酶标技术</li>
<li>免疫胶体金技术，优点： 在电镜下金颗粒容易识别， 并可以制成5nm、10nm 或20nm 等不同直径的金颗粒， 用以双重标记或多重标记。</li>
</ul>
<blockquote>
<p>其主要区别是与抗体结合的标志物不同， 这在一定程度上也反映了免疫电镜技术的发展过程。</p>
<p>目前， 免疫铁蛋白技术几乎已无人间津， 而免疫胶体金技术则受到越来越多的青睐。</p>
</blockquote>
<p><strong>样品制备程序</strong>包括：包括样品的固定、包埋、超薄切片制备、免疫标记和染色等步骤</p>
<blockquote>
<p>技术关键是既要保持样品中蛋白的抗原性， 又要尽最保存样品的精细结构。</p>
</blockquote>
<hr>
<h3 id="细胞内特异核酸的定位与定性"><a href="#细胞内特异核酸的定位与定性" class="headerlink" title="细胞内特异核酸的定位与定性"></a>细胞内特异核酸的定位与定性</h3><p>采用<strong>原位杂交技术</strong>研究细胞内特异核酸的定位与定性。</p>
<p><strong>原位杂交</strong>：用特异性标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置的<br>方法。</p>
<p><strong>标记探针方法</strong>：放射性同位素标记；荧光素标记；生物素等生物小分子。</p>
<p><strong>应用</strong>：原位杂交技术在显微与亚显微水平上研究<strong>基因定位</strong>、<strong>特异mRNA 表达</strong>等问题的研究中具有重要作用</p>
<hr>
<h3 id="定量细胞化学分析与细胞分选技术"><a href="#定量细胞化学分析与细胞分选技术" class="headerlink" title="定量细胞化学分析与细胞分选技术"></a>定量细胞化学分析与细胞分选技术</h3><p><strong>目的</strong>：蛋白质或核酸等生物大分子在某个细胞中或细胞群体中的含量分析</p>
<p><strong>用途</strong>：<strong>流式细胞术</strong>可定量地测定某一细胞中的DNA、RNA或某一特异的标记蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞的数量，还可将某一特异染色的细胞从数以万计的细胞群体中分离出来，以及将DNA含量不同的中期染色体分离出来， 甚至可用干细胞的分选。</p>
<p><strong>原理</strong>：</p>
<ul>
<li><p>细胞群体一般需要分散后对待测的某种成分进行特异的荧光染色， 然后便悬液中的细胞一个个快速通过流式细胞仪（每秒可达几万个细胞）。</p>
</li>
<li><p>当含有单个细胞的液滴通过激光束时， 带有不同荧光的细胞所在的液滴被充上正电荷、负电荷， 或不被充电， 同时检测器可测出并记录每个细胞中的待测成分的含量。</p>
</li>
<li><p>因带有不同表面标志的细胞所带的电荷的种类不同， 当液滴通过高压偏转板时， 带不同电荷的液滴发生偏转， 从而达到将细胞分选的目的。</p>
<blockquote>
<p>如果染色过程不影响细胞活性， 那么分离出来的细胞还可以继续培养。</p>
</blockquote>
</li>
</ul>
<hr>
<h2 id="细胞培养与细胞工程技术"><a href="#细胞培养与细胞工程技术" class="headerlink" title="细胞培养与细胞工程技术"></a>细胞培养与细胞工程技术</h2><h3 id="细胞培养"><a href="#细胞培养" class="headerlink" title="细胞培养"></a>细胞培养</h3><h4 id="动物细胞培养"><a href="#动物细胞培养" class="headerlink" title="动物细胞培养"></a>动物细胞培养</h4><p>原代细胞和传代细胞</p>
<ul>
<li><strong>原代细胞</strong>是指从机体取出后立即培养的细胞。</li>
<li><strong>传代细胞</strong>是指适应在体外培养条件下持续传代培养的细胞。</li>
</ul>
<p>原代培养和传代培养</p>
<ul>
<li><strong>原代培养</strong>是指从机体内取出的组织或者细胞直接进行培养， 培养至第10 代的细胞培养过程。</li>
<li><strong>传代培养</strong>是指原代细胞增殖到一定程度后取出放入新的培养基培养的过程。</li>
</ul>
<p>原代细胞培养步骤：</p>
<ul>
<li><p>首先取出健康动物的组织块， 剪碎， 用浓度与活性适中的胰酶或胶原酶与EDTA （赘合剂） 等将细胞连接处消化分散</p>
</li>
<li><p>给予良好的营养液与无菌的培养环境（接近体温与体内pH ) ,在培养中进行静止或慢速转动培养。</p>
<blockquote>
<p>但不论用何种培养液一般都要加一定最的小牛（或胎牛） 血清， 这样细胞才能很好地贴壁生长与分裂。</p>
</blockquote>
</li>
</ul>
<hr>
<p><strong>细胞贴壁</strong>：分散的细胞悬液在培养瓶中很快（在几十分钟至数小时内） 就贴附在瓶壁上， 称为细胞贴壁。</p>
<p><strong>单层细胞培养</strong>：是指分散呈圆球形的细胞一经贴壁就迅速铺展并开始有丝分裂，逐渐形成致密细胞单层（称为单层细胞）的培养方法。</p>
<p><strong>细胞系</strong>：是指经过原代培养10 代后少数存活能继续顺利地传40~50代次，并且仍保持原来染色体的二倍体数量及接触抑制的行为的传代细胞， 分为<strong>有限细胞系</strong>和<strong>永生细胞系</strong>。</p>
<ul>
<li>有限细胞系：是指传代培养到第50代时难以再继续存活下去的细胞系。</li>
<li>永生细胞系（连续细胞系）：是指在传代过程中的部分细胞发生了遗传突变，并使其带有癌细胞的特点，有可能在培养<br>  条件下无限制地传代培养下去的细胞系。<blockquote>
<p>常用的连续细胞系：<br>HeLa细胞系（来自宫颈瘤细胞）<br>BHK21(baby hamster kidney) 细胞系<br>CHO (chinese hamster ovany) 细胞系</p>
</blockquote>
</li>
</ul>
<hr>
<p><strong>细胞克隆</strong>：是指用单细胞克隆培养或通过药物筛选的方法从某一细胞系中分离出单个细胞，并由此增殖形成的具有基本相同的遗传性状的细胞群体。</p>
<p><strong>细胞株</strong>：是指细胞系中经过生物学鉴定的具有特殊的遗传标记或性质的细胞克隆。</p>
<p>体外培养细胞的基本形态：成纤维样细胞，上皮样细胞。</p>
<p>某些传代细胞还可用悬浮方法培养。其培养条件比较复杂， 悬浮培养的最大优点是在有限的培养液中获得大量细胞。</p>
<hr>
<h4 id="植物细胞培养"><a href="#植物细胞培养" class="headerlink" title="植物细胞培养"></a>植物细胞培养</h4><p><strong>单倍体细胞培养</strong>：主要用花药在人工培养基上进行培养。</p>
<p><strong>原生质体</strong>：一般用植物的体细胞（二倍体细胞），先经纤维素酶处理去掉细胞壁， 去壁的细胞称为原生质体。</p>
<p><strong>原生质体培养</strong>：</p>
<ul>
<li>原生质体在无菌培养基中可以生长与分裂， 经过诱导发育成完整植株；</li>
<li>不同植物的原生质体进行融合与体细胞杂交， 可获得体细胞杂交的植株。</li>
</ul>
<hr>
<h3 id="细胞工程"><a href="#细胞工程" class="headerlink" title="细胞工程"></a>细胞工程</h3><p>细胞工程所涉及的主要技术包括<strong>细胞培养</strong>、<strong>细胞分化的定向诱导</strong>、<strong>细胞融合</strong>和<strong>显微注射</strong>等。</p>
<h4 id="细胞融合与单克隆抗体技术"><a href="#细胞融合与单克隆抗体技术" class="headerlink" title="细胞融合与单克隆抗体技术"></a>细胞融合与单克隆抗体技术</h4><p><strong>细胞融合</strong>：是指两个或多个细胞融合成一个双核或多核细胞的现象。</p>
<p>细胞<strong>融合方法</strong>：</p>
<ul>
<li><p>灭活的病毒（如仙台病毒） 作为促融剂；</p>
</li>
<li><p>植物细胞融合时， 要先用纤维素酶去掉细胞壁， 然后才便于原生质体融合；</p>
</li>
<li><p>化学物质（如聚乙二醇，PEG）作为促融剂；</p>
</li>
<li><p>电融合技术方法。</p>
<blockquote>
<p>将悬浮细胞在低压交流电场中聚集成串珠状细胞群， 或对相互接触的单层培养细胞， 再施加高压电脉冲处理使其融合</p>
</blockquote>
</li>
</ul>
<p>细胞<strong>融合分类</strong></p>
<blockquote>
<p>细胞融合可以在基因型相同的细胞间进行， 也可在基因型不同的种内细胞间甚至种间细胞间进行。</p>
</blockquote>
<ul>
<li>同核体：基因型相同的细胞形成的融合细胞。</li>
<li>异核体：基因型不同的细胞形成的融合细胞。</li>
</ul>
<h4 id="单克隆抗体技术"><a href="#单克隆抗体技术" class="headerlink" title="单克隆抗体技术"></a>单克隆抗体技术</h4><p>单克隆抗体技术是基于细胞融合研究的基础上建立的细胞工程技术。</p>
<p><strong>原理</strong>：将抗原免疫过的B 淋巴细胞同小鼠骨髓瘤细胞融合，形成能产生针对该特异抗原的特异性抗体且能够无限增殖的杂交瘤细胞， 即能大量分泌单克隆抗体。</p>
<p><strong>优点</strong>：是可以用混合性的异质抗原制备出针对某单一性抗原分子上特异决定族的同质性单克隆抗体</p>
<p><strong>用途</strong>：单克隆抗体技术与基因克隆技术相结合为分离和鉴定新的蛋白质和基因开辟了一条广阔途径，可用于临床诊断与肿瘤等疾病的治疗。</p>
<hr>
<h4 id="显微操作技术与动物的克隆"><a href="#显微操作技术与动物的克隆" class="headerlink" title="显微操作技术与动物的克隆"></a>显微操作技术与动物的克隆</h4><p><strong>细胞拆合</strong>：是指把细胞核与细胞质分离开来，然后把不同来源的胞质体和核体相互组合，形成核质杂交细胞的过程。</p>
<p><strong>细胞拆合类型</strong>：</p>
<ul>
<li><p>物理法：用机械方法或短波光去掉细胞核或使之失活，然后用微吸管吸取其他细胞的核，注入去核的细胞质中，组成新的杂交细胞。这种核移植必须用显微操纵仪进行操作。</p>
<blockquote>
<p>显微操作技术：即在显微镜下， 用显微操作装置对细胞进行解剖和微量注射的技术。</p>
<p>现在显微操作装置的设计愈来愈精密， 不仅用千核移植， 而且亦可对细胞核进行解剖和向核内注入基因</p>
</blockquote>
</li>
<li><p>化学法：用细胞松弛素B处理细胞， 细胞出现排核现象， 再结合离心技术， 将细胞拆分为核体和胞质体两部分。</p>
</li>
</ul>
<blockquote>
<p>细胞拆合、显微注射与现代分子生物学技术相结合使这些经典的胚胎学技术展现出极大的潜力， 它不仅成为核质关系、细胞内某种mRNA 或蛋白质功能等基础研究的重要手段， 而且在转基因动物、高等动物的克隆方面的理论与实践研究中取得了重大的突破。</p>
</blockquote>
<h2 id="细胞及生物大分子的动态变化"><a href="#细胞及生物大分子的动态变化" class="headerlink" title="细胞及生物大分子的动态变化"></a>细胞及生物大分子的动态变化</h2><h3 id="荧光漂白恢复技术"><a href="#荧光漂白恢复技术" class="headerlink" title="荧光漂白恢复技术"></a>荧光漂白恢复技术</h3><p><strong>荧光漂白恢复（FPR）技术</strong>：是指使用亲脂性或亲水性的荧光分子与蛋白或脂质耦联，用于检测所标记分子在活体细胞表面或细胞内部的运动及其迁移速率的技术。</p>
<p><strong>原理</strong>：</p>
<ul>
<li>利用高能激光束照射细胞的某一特定区域， 使该区域内标记的荧光分子发生不可逆的悴灭， 这一区域称光漂白区。</li>
<li>随后，由于细胞中脂质分子或蛋白质分子的运动， 周围非漂白区的荧光分子不断向光漂白区迁移。</li>
<li>结果使光漂白区的荧光强度逐渐地恢复到原有水平。这一过程称荧光恢复。</li>
</ul>
<p><strong>作用</strong>：给出活细胞内脂质或蛋白质运动的定性的结果，获得某些定量的信息， 有助于解决细胞内脂质和蛋白质分子的动态变化以及与其他成分相互作用等一系列问题。</p>
<h3 id="单分子技术与细胞生命活动的研究"><a href="#单分子技术与细胞生命活动的研究" class="headerlink" title="单分子技术与细胞生命活动的研究"></a>单分子技术与细胞生命活动的研究</h3><p><strong>单分子技术</strong>：是指在细胞内实时观测单一生物分子运动规律的技术。</p>
<p><strong>作用</strong>：可以在纳米空间尺度和毫秒时间尺度上精确测量单分子的距离、位置、指向、分布、结构以及各种动态过程。</p>
<p><strong>优点</strong>：实时直接观测单个分子的反应动力学路径，测量单一分子及分子间相互作用， 捕捉单分子随机过程和分子构象变化的中间态， 测最稀发但重要的信号和分布， 测量非平衡态和不同步的体系等。</p>
<p><strong>工作原理</strong>：</p>
<ul>
<li><p><strong>单分子光谱及成像</strong>基于分子的内禀光谱以及与周围环境和分子的作用来测盐单一分子对光的响应（荧光、共振能量转移、散射和吸收等） 或对化学条件的响应（如酶催化和电子转移等） 。</p>
<blockquote>
<p>目前常见的单分子光谱及成像技术有单分子荧光、暗场成像、近场成像和Forster 共振能量转移等。</p>
</blockquote>
</li>
<li><p><strong>单分子操纵及力学性质测</strong>：使用高精度、高灵敏度的操纵和检测仪器直接或间接对单分子进行力学操纵和测昼的技术。</p>
<blockquote>
<p>目前常见的方法有光摄、磁摄和原子力显微镜等</p>
</blockquote>
</li>
</ul>
<p><strong>应用</strong>：</p>
<ul>
<li>心分子马达， 如细胞骨架马达蛋白和旋转马达等；</li>
<li>核酸马达， 如RNA 聚合酶、DNA 聚合酶、解旋酶和拓扑异构酶等；</li>
<li>细胞信号通路， 如钾离子通道、神经突触等；</li>
<li>细胞器以及细胞骨架、染色质等精细结构以及特异蛋白的分布；</li>
<li>细胞的分裂、迁移、胞吞、胞吐等过程</li>
<li>蛋白质和DNA 单分子力学。如折叠、展开、螺旋、解旋等构象变化以及配体作用的力学强度</li>
<li>生物大分子的动态作用过程如蛋白质－ 核酸、蛋白质— 蛋白质、蛋白质复合物、蛋白质— 膜脂等方面</li>
</ul>
<p>单分子技术具有其他技术不可替代的优越性。可以预计单分子技术在细胞分子生物学领域的应用将极大地推动生命科学的发展。</p>
<h3 id="酵母双杂交技术"><a href="#酵母双杂交技术" class="headerlink" title="酵母双杂交技术"></a>酵母双杂交技术</h3><p><strong>酵母双杂交系统</strong>：是一种利用单细胞真核生物酵母在体内分析蛋白质—蛋白质相互作用的系统。</p>
<p><strong>原理</strong>：</p>
<ul>
<li>细胞基因转录起始需要转录激活因子的参与， 转录激活因子一般由两个或两个以上相互独立的结构域构成，<br>即DNA 结合域( DB)和转录激活域(AD)， 前者可识别DNA 上的特异转录调控序列并与之结合；后者可与其他成分作用形成转录复合体， 从而启动它所调节的基因的转录。</li>
<li>分别制备DB 与蛋白A 的融合蛋白， 以及AD与蛋白B或可能与蛋白A 发生作用蛋白的融合蛋白， 在细胞内表达， 可证明蛋白A 是否与蛋白B 在细胞内相互作用或寻找与蛋白A 可能发生作用的蛋白。</li>
</ul>
<p><strong>优点</strong>：高灵敏度、快速、直接。</p>
<p><strong>应用</strong>：用于细胞信号转导网络等系统中各种蛋白质的相互关系的研究。</p>
<h3 id="荧光共振能量转移技术"><a href="#荧光共振能量转移技术" class="headerlink" title="荧光共振能量转移技术"></a>荧光共振能量转移技术</h3><p>荧光共振能量转移（FRET）技术是用来检测活细胞内两种蛋白质分子是否直接相互作用的重要手段。</p>
<p><strong>基本原理</strong>：供体发射的荧光与受体发色团分子的吸收光谱重叠， 距离在10nm 以内， 就会发生一种非放射性的能量转移现象， 即产生FRET 现象， 作用前后发出的荧光不同。</p>
<p><strong>应用</strong>：FRET 技术用千检测体内两种蛋白质之间是否存在直接的相互作用。</p>
<h3 id="放射自显影技术"><a href="#放射自显影技术" class="headerlink" title="放射自显影技术"></a>放射自显影技术</h3><p><strong>放射自显影技术</strong>：是指利用放射性同位素的电离射线对乳胶（含AgBr 或AgCl）的感光作用， 对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术。</p>
<p><strong>主要步骤</strong>：</p>
<ul>
<li>切掺入同位素标记的生物大分子前体；</li>
<li>显示细胞内同位素所在位置。</li>
</ul>
<p><strong>应用</strong>：对细胞或生物体内生物大分子进行动态研究和追踪。</p>
<h2 id="模式生物与功能基因组的研究"><a href="#模式生物与功能基因组的研究" class="headerlink" title="模式生物与功能基因组的研究"></a>模式生物与功能基因组的研究</h2><h3 id="细胞生物学研究常用的模式生物"><a href="#细胞生物学研究常用的模式生物" class="headerlink" title="细胞生物学研究常用的模式生物"></a>细胞生物学研究常用的模式生物</h3><p>模式生物<strong>特点</strong>：个体较小， 容易培养， 操作简单， 生长繁殖快。</p>
<p>常用的模式生物：噬菌体、大肠杆菌、酵母、四膜虫、黏菌、爪蟾、海胆、拟南芥、线虫、果蝇、斑马鱼和小鼠等。</p>
<ol>
<li><p><strong>大肠杆菌</strong>：原核生物的代表</p>
<blockquote>
<p>其基因组序列已千1997 年测定完毕，一条环状DNA 只有4.6X1 0<sup>3</sup> kb , 大约编码4288个基因</p>
</blockquote>
<ul>
<li>培养方便，生长快</li>
<li>基因结构简单， 突变株的诱变、分离和鉴定容易</li>
<li>转基因技术成熟， 进行基因定位简便易行。</li>
</ul>
<blockquote>
<p>早期关于基因表达调控的一些研究成果大多是以此为材料取得的。</p>
</blockquote>
</li>
<li><p><strong>酵母</strong>：单细胞真核生物的代表，生物学研究的酵母主要有两种： 芽殖酵母和裂殖酵母</p>
<blockquote>
<p>酵母不仅具有与细菌类似的一些优点， 而且具有真核细胞的组织结构， 即有细胞核和各种细胞器。</p>
<p>芽殖酵母（单倍体） 含有16 条线性的染色体， 其基因组全长为1.2 X 10<sup>4</sup>kb, 具有约6000 个可读框。<br>裂殖酵母的基因组大小与芽殖酵母相近， 但仅分布在3 条染色体上， 编码约4800 个蛋白质。</p>
</blockquote>
<ul>
<li><p>非常简单的单细胞真核生物， 生长迅速并且易于遗传操作</p>
</li>
<li><p>酵母染色体的结构与所有的真核生物一样具有自主复制序列、着丝点序列和端粒序列</p>
<blockquote>
<p>利用这3个结构元件可以构建酵母人工染色体用千大片段DNA 序列的克隆和分析</p>
</blockquote>
</li>
<li><p>酵母基因突变库为蛋白质相互作用、基因表达调控、膜泡运输、细胞分化和衰老等研究领域提供了非<br>常重要的研究材料</p>
</li>
</ul>
</li>
<li><p><strong>线虫</strong>：实验室常用的是秀丽隐杆线虫(<em>Caenorhabditis elegans</em> )</p>
<blockquote>
<p>它的基因组序列也已经测定完成， 全长为9.7X 10<sup>4</sup> kb , 大约编码19000 个基因</p>
<p>线虫成体长仅1mm 左右， 由959个体细胞组成</p>
</blockquote>
<ul>
<li>线虫繁殖快， 生命周期仅为3 天， 在显微镜下通体透明， 可以追踪体内每一个细胞的形成；</li>
<li>胚胎发育过程中细胞分裂、分化以及细胞的死亡具有高度的程序性， 便于对其进行遗传学分析。</li>
</ul>
<blockquote>
<p>秀丽隐杆线虫已经成为现代发育生物学、遗传学、细胞生物学研究的重要模式生物</p>
</blockquote>
</li>
<li><p><strong>果蝇</strong>：实验室常用的是黑腹果蝇（<em>Drosophila melanogaster</em>）</p>
<blockquote>
<p>其基因组序列测定已经完成； 全长为1. 8 X 10<sup>5</sup> kb , 大约编码13600 个基因。</p>
</blockquote>
<ul>
<li>果蝇具有丰富的表型特征， 易于进行遗传学操作；</li>
<li>果蝇基因组中许多基因在进化上很保守， 与人类基因有很高的同源性。</li>
</ul>
<blockquote>
<p>果蝇作为经典遗传学的模式生物已经有100多年的历史，</p>
<p>曾在遗传分析、染色体特性研究、胚胎发育的基因调控和细胞分化机制的研究、神经退行性疾病和学习、认知等领域的研究发挥重要的作用。</p>
</blockquote>
</li>
<li><p><strong>斑马鱼</strong></p>
<blockquote>
<p>属小型脊椎动物， 因全身分布有褐色斑纹而得名。</p>
<p>斑马鱼的基因数目大约为30000 个，与人类的相近，</p>
</blockquote>
<ul>
<li><p>它的许多基因与人类的基因存在一一对应的关系；</p>
</li>
<li><p>斑马鱼很容易饲养；</p>
<blockquote>
<p>一般在孵化后3 个月就可以到达性成熟， 每次可产卵200 个左右。</p>
</blockquote>
</li>
<li><p>斑马鱼的整个胚胎发育过程在体外完成， 鱼卵产出以后仅1天即可完成胚胎早期发育。</p>
</li>
<li><p>透明的鱼卵和胚胎使对其胚胎发育过程中细胞行为的观察与研究极为便利。</p>
</li>
</ul>
</li>
<li><p><strong>小鼠</strong></p>
<blockquote>
<p>其基因组全长为3.0 x10<sup>6</sup>kb ,大约编码30000个基因， 与人类的非常相近。</p>
</blockquote>
<ul>
<li><p>作为小型哺乳动物，小鼠在进化方面最接近人类；</p>
</li>
<li><p>可用于建立人类疾病的小鼠模型， 用于相关疾病分子机制的研究， 也为疾病治疗的临床前研究提供了极为重要的动物模型；</p>
</li>
</ul>
<blockquote>
<p>小鼠常常作为哺乳动物遗传学、组织学、胚胎学和细胞生物学等的研究材料。</p>
<p>近年来，转基因小鼠、基因打靶、条件基因打靶及RNA 干涉等技术在小鼠中的建立与发展， 极大地促进了高等动物功能基因组学的研究。</p>
</blockquote>
</li>
<li><p><strong>拟南芥</strong>：十字花科的植物</p>
<blockquote>
<p>拟南齐有5 对染色体， 基因组全长1.25x10<sup>5</sup>kb , 共编码约26000 个基因，是目前已知最小的植物基因组。</p>
</blockquote>
<ul>
<li>个体小，高度只有30 cm左右；</li>
<li>生长周期快，从播种到收获种子一般只需6周左右；</li>
<li>种子多，每株每代可产生数千粒种子；</li>
<li>生活力强， 用普通培养基就可做人工培养。</li>
<li>它是自花授粉植物， 容易获得各种突变株。</li>
</ul>
</li>
</ol>
<h3 id="突变体制备技术"><a href="#突变体制备技术" class="headerlink" title="突变体制备技术"></a>突变体制备技术</h3><p>制备突变体的方法主要从DNA 与RNA两个层次上进行。</p>
<p><strong>1. RNA 水平</strong>：主要是RNA 干扰的方法， 这里包括瞬时的与永久的干扰。</p>
<p><strong>RNAi</strong> ：</p>
<ul>
<li>利用一段特异的双链RNA 或单链反义RNA 通过注射、转染或转基因的方法导入到到细胞或模式生物体中，</li>
<li>RNA启动一套信号通路来最终降解与这段RNA 对应的mRNA, 使该mRNA 无法翻译成相关的蛋白质，</li>
<li>从而在mRNA层面上阻断了对应基因的功能， 达到了制备某一基因突变体的目的。</li>
</ul>
<p>优点：实验周期较短，</p>
<p>缺点：有时特异性不够强。</p>
<blockquote>
<p>在绝大多数模式生物中都是可以通过RNAi 的方法实现某一基因功能的失活</p>
</blockquote>
<hr>
<p><strong>2. DNA 水平</strong>：在DNA 水平制备突变体的方法通常也叫基因敲除</p>
<p><strong>基因敲除</strong>：是指利用外源DNA 与细胞内DNA 有类似序列而发生同源重组，导致细胞内目的基因片段被替换而丧失表达能力的技术， 是在DNA 水平制备突变体的一种方法。</p>
<p>通常<strong>DNA 水平突变体的制备方法</strong>有三种（以果蝇为例） ：</p>
<ul>
<li><p>化学诱变法</p>
<blockquote>
<p>化学诱变是一种传统的突变技术， 主要通过给果蝇喂食添加有化学诱变剂的食物从而造成果蝇配子染色体的突变。</p>
<p>这种突变往往是随机发生的点突变（或者是染色体DNA 小片段的缺失），其诱变的效率很高， 但诱变的基因往往难以克隆定位。</p>
<p>甲基磺酸乙酯（EMS）和乙基亚硝基脲（ENU）是较为常用的化学诱变剂。</p>
</blockquote>
</li>
<li><p>P因子介导的突变</p>
<blockquote>
<p>P 因子介导的突变利用转座子的转座特性及转座子的移动过程中可以带走部分基因组DNA 序列的特性改变基因的表达或结构。</p>
<p>优点：P 因子携带有显性标记， 如眼色、体色、药物抗性等， 通过观察这些显性标记就可以判断P<br>因子整合或跳出成功与否</p>
<p>缺点：突变的效率较低， 并且突变的位点有较强的选择性</p>
</blockquote>
</li>
<li><p>基于同源重组的定点突变</p>
<blockquote>
<p>优点： 受基因位置的限制少， 特异性高， 能在DNA 水平上产生可遗传的任何想要的定点突变。</p>
<p>缺点：相对较耗时、耗力。</p>
</blockquote>
</li>
</ul>
<blockquote>
<p>前两种方法属于<strong>正向遗传学</strong>的方法</p>
<p>后一种方法和上面提到的RNAi的方法则属于<strong>反向遗传学</strong>于的方法。</p>
</blockquote>
<hr>
<h3 id="蛋白质组学技术"><a href="#蛋白质组学技术" class="headerlink" title="蛋白质组学技术"></a>蛋白质组学技术</h3><p><strong>蛋白质组</strong>：是由蛋白质与基因组两个词组合而成，意指“ 一种基因组所表达的全部蛋白质”。</p>
<p><strong>蛋白质组学</strong>：是全面研究细胞、组织乃至整个生命体内蛋白质组成及其活动规律的科学。</p>
<h4 id="双向凝胶电泳"><a href="#双向凝胶电泳" class="headerlink" title="双向凝胶电泳"></a>双向凝胶电泳</h4><p><strong>双向凝胶电泳（2-DE）</strong>：是一种高分辨率的蛋白质分离技术</p>
<ul>
<li>第一相是等电聚焦电泳（IEF）， 采用pH梯度， 根据蛋白质等电点的不同进行分离；</li>
<li>第二相是SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），根据蛋白质相对分子质量的大小进行分离。</li>
</ul>
<p><strong>优点</strong>： 分辨率高，一般能分辨到1000 - 3000 个蛋白质点， 最佳可分离得到11000 个左右的蛋白质样点。</p>
<p><strong>缺点</strong>：强酸性、强碱性的蛋白质， 相对分子质量过大、过小的蛋白质， 疏水性的蛋白质以及一些低度蛋白质难以分离；实验的重复性差。</p>
<hr>
<h4 id="色谱技术"><a href="#色谱技术" class="headerlink" title="色谱技术"></a>色谱技术</h4><p><strong>色谱技术</strong>：是指利用各种物质在固定相和流动相之间不同的分配系数，使其在相对运动的两相间经反复多次分配， 以不同速度移动， 从而获得分离的技术。</p>
<p><strong>多维液相色谱</strong>：采用两种或两种以上不同的分离机制组合， 利用样品的不同特性（ 如分子大小、等电点、亲水性等）将复杂的混合物分离成单一组分。</p>
<p>多维液相色谱具有快速、高通最、自动化的特点。</p>
<p><strong>毛细管电色谱</strong>：通过在毛细管柱内填充液相色谱固定相或在柱壁键合固定相， 使带电物质在高压电场和固定相介质的共同作用下分离。</p>
<p>毛细管电泳是经典电泳技术和现代微柱分离技术相结合的产物， 具有极高的分辨率。</p>
<p>该技术集成了毛细管电泳的高效分离性与HPLC 的高选择性。</p>
<blockquote>
<p>毛细管电色谱和多维液相色谱由于分辨率高， 所需样品量少， 易于和电喷雾离子化质谱联用而成为蛋白质组分析的重要手段。</p>
</blockquote>
<hr>
<h4 id="质谱"><a href="#质谱" class="headerlink" title="质谱"></a>质谱</h4><p><strong>原理</strong>：通过离子化装置将分子转化为气态离子，根据不同离子间质荷比的差异来分离并确定相对分子质量。</p>
<p><strong>优点</strong>：能灵活地与多种蛋白分离技术联用， 且灵敏度、准确度高。</p>
<p><strong>应用</strong>：鉴定蛋白质并准确测量肤段和蛋白质的相对分子质量、氨基酸序列及翻译后的修饰。</p>
<hr>
<h4 id="蛋白质芯片"><a href="#蛋白质芯片" class="headerlink" title="蛋白质芯片"></a>蛋白质芯片</h4><p><strong>蛋白质芯片</strong>：是指将蛋白质结合到固相基质上， 然后与要检测的组织或细胞“ 杂交＂， 从而对未知蛋白进行分离和鉴定的技术。</p>
<p><strong>原理</strong>：  利用蛋白质间以及蛋白质与其他小分子间的相互作用。</p>
<p><strong>优点</strong>：高通量、高特异性、高灵敏度（检测水平达n g 级）， 适用千蛋白质表达谱分析。</p>
<hr>
<h4 id="生物信息学"><a href="#生物信息学" class="headerlink" title="生物信息学"></a>生物信息学</h4><p>生物信息学在蛋白质组学方面的应用：</p>
<ul>
<li>构建与分析蛋白质双向凝胶电泳图谱数据库；</li>
<li>蛋白质氨基酸序列、蛋白质结构域、蛋白质相互作用等数据库的建立和检索；</li>
<li>蛋白质结构的预测；</li>
<li>蛋白质结构和功能预测、蛋白质双向电泳图谱分析、蛋白质鉴定等软件的开发与应用。</li>
</ul>

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